新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）大流行導(dǎo)致了公共衛(wèi)生危機和全球恐慌，到目前為止確診人次已經(jīng)超過二億二千萬例。Delta、Lambda新冠變異病毒已經(jīng)出現(xiàn)在全球90多個國家。如何快速準確診斷病毒特別是變異株，對治療和防疫工作具有重要意義。逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）是國內(nèi)應(yīng)用最廣泛的新冠檢測技術(shù)。在疫情防控工作中，不同的核酸檢測技術(shù)也得到了快速的發(fā)展，包括數(shù)字PCR（dPCR），逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（RT-LAMP）和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增（TMA）等。dPCR是一種新興的核酸擴增技術(shù)，允許絕對定量核酸。它具有靈敏度高、精度高、抗干擾能力強等優(yōu)點。
01 什么是數(shù)字PCR
數(shù)字PCR技術(shù)也稱為第三代PCR技術(shù)，是一種核酸高靈敏檢測和絕對定量的新方法。同傳統(tǒng)的PCR相比，數(shù)字PCR增加了對反應(yīng)體系進行分隔（Partition）的操作，將幾十微升的反應(yīng)體系分隔成了數(shù)萬微小獨立反應(yīng)體系，核酸模板在這種分隔過程中被充分稀釋，理想狀態(tài)下每個微滴中含有1個分子的核酸模板，擴增完成后對所有的液滴進行熒光信號識別并計數(shù)，計算出陰性和陽性反應(yīng)的數(shù)量，通過泊松分布原理計算靶標分子的濃度。從而實現(xiàn)靶標分子的絕對定量。數(shù)字PCR不依賴標準曲線定量，并且不受PCR擴增效率影響，具有更高靈敏度和準確度。
02 數(shù)字PCR的由來
◇ 2003年，Kinzler和Vogelstein繼續(xù)完善dPCR，并創(chuàng)建了一種改進的方法，他們將其稱為BEAMing技術(shù)，即“珠子，乳狀液，擴增和磁性”的首字母縮寫。BEAMing技術(shù)使用乳狀液在單個試管中分隔擴增反應(yīng)。這一變化能在一次運行中將該PCR擴展到成千上萬的反應(yīng)。
隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)（nanofabrication and microfluidics）的發(fā)展，數(shù)字PCR技術(shù)遇到了突破瓶頸的最佳契機。
◇ 2006年，F(xiàn)luidigm公司推出了第一臺商業(yè)化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)，F(xiàn)luidigm的IFC平臺使用物理矩陣的策略，他們的qdPCR 37K系統(tǒng)“集成電路”利用該公司的微流控專長，可將48個樣品逐個分布在770個微反應(yīng)單元中。
◇ 2013年，Life technologies推出了QuantStudio3D數(shù)字PCR系統(tǒng)。采用高密度的納升流控芯片技術(shù)，樣本均勻分配至20000個單獨的反應(yīng)孔中。在整個工作流程中，樣本之間保持完全隔離，可以有效防止樣品交叉污染，減少移液過程，簡化操作步驟。同時芯片式設(shè)計避免了微滴式系統(tǒng)可面臨的管路堵塞問題。
◇ 目前，dPCR的基本方法都已經(jīng)建立，根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式，主要可分為微板式、微腔式和微滴式三大類系統(tǒng)。目前，市場上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統(tǒng)和Thermo Fisher公司的Quant Studio系統(tǒng)等。
03 數(shù)字PCR的優(yōu)勢
數(shù)字PCR是生命科學(xué)領(lǐng)域最引人矚目的創(chuàng)新之一。與其他傳統(tǒng)分子診斷技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)的優(yōu)勢在于:
? 高靈敏度，可實現(xiàn)單分子級檢測
dPCR本質(zhì)上將一個傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)變成了數(shù)萬個PCR反應(yīng)， 在這數(shù)萬個反應(yīng)單元中分別獨立檢測目的序列，從而大大提高了檢測的靈敏度。
? 高精度，可檢測微小差異
在大量野生型基因存在的情況下精準地檢測低含量的突變基因是目前的研究難點之一，競爭性反應(yīng)嚴重影響突變基因的檢測。dPCR技術(shù)從背景序列中檢測低豐度目的序列的能力和高靈敏度的特點使得這一技術(shù)特別適合在復(fù)雜背景中檢測稀有突變。
? 絕對定量，不依賴標準品和參考曲線
數(shù)字PCR直接計算目的序列的拷貝數(shù)，無需依賴于Ct值和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測。
? 高重復(fù)性，消除擴增效率偏差影響
FAM、HEX和Cy5通道濃度平均值和CV值的數(shù)據(jù)表明， 在所述的實驗條件下，三種測試濃度之間沒有統(tǒng)計學(xué)差 異(p<0.05)。
? 強耐受抑制物，適用于多種復(fù)雜樣本
血液、糞便、食品、土壤等樣本中含有大量PCR反應(yīng)的抑制物，極大地影響 了PCR反應(yīng)效率。另外，在某些檢測中，難以制備測定標準曲線所需的標準物質(zhì)。dPCR不受PCR抑制物的影響、不依賴標準曲線的優(yōu)勢，使其特別適合于這些復(fù)雜樣本中基因表達的準確定量檢測。
04 應(yīng)用領(lǐng)域
科學(xué)界對于數(shù)據(jù)準確性和結(jié)果可靠性的要求越來越高，更多的實驗室將目光轉(zhuǎn)向擁有絕對定量方式、高靈敏度和高重復(fù)性特質(zhì)的數(shù)字PCR技術(shù)。dPCR作為一種新興的靶核酸絕對定量技術(shù)，對低豐度DNA具有高度的敏感性和特異性，對擴增抑制劑具有高度的抗性。因此，dPCR可用于低拷貝病毒的檢測、病毒載量的測定、標準物質(zhì)的制備、環(huán)境中病毒濃度的監(jiān)測、病毒變異的檢測和SARS-CoV-2藥物的評價。
05 數(shù)字PCR應(yīng)用常見問題
06 Vazyme可以提供
