1999年，美國學(xué)者Kenneth Kinzler和BertVogelstein首次提出“數(shù)字PCR（digitalPCR，dPCR）”概念，該技術(shù)通過數(shù)數(shù)的方法，實現(xiàn)核酸分子的絕對定量。
圖1.數(shù)字PCR發(fā)展
在介紹數(shù)字PCR之前，首先和大家回顧一下熒光定量PCR技術(shù)（real time PCR,qPCR），也就是COVID-19檢測的金標準技術(shù)。熒光定量PCR在操作流程上包括：a.核酸分子提??；b.RNA逆轉(zhuǎn)錄；c.熒光定量PCR檢測這三步驟。在檢測原理上熒光定量PCR主要包括兩種方法：a.染料法（SYBRGreen或Eva Green）；b.Taqman探針法。
數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）
數(shù)字PCR技術(shù)，是一種熒光定量PCR技術(shù)的升級技術(shù)。依然是利用染料法或Taqman探針法進行的熒光檢測，不同的是dPCR是終點檢測熒光信號，qPCR是實時檢測熒光信號。而數(shù)字PCR之所以是熒光定量的升級技術(shù)，主要是利用單分子擴增實現(xiàn)核酸的絕對定量。數(shù)字PCR將單個DNA分子置于獨立的反應(yīng)室中，并對其進行PCR擴增，利用TaqMan探針法或染料法檢測特定的靶序列。因此，數(shù)字PCR檢測主要包括三步：第一，通過特定技術(shù)將PCR反應(yīng)混合液分散到幾萬個反應(yīng)單元（反應(yīng)室）；第二，單分子在反應(yīng)室中擴增；第三，PCR結(jié)束后檢測熒光信號，最后通過泊松分布統(tǒng)計數(shù)數(shù)，計算出樣本的拷貝數(shù)，實現(xiàn)核酸分子的絕對定量。與qPCR相比dPCR的絕對定量不需要利用標準曲線實現(xiàn)定量，而是直接可以通過單分子擴增結(jié)合泊松分布統(tǒng)計，既可實現(xiàn)絕對定量。
因此，數(shù)字PCR與熒光定量PCR不同點，主要體現(xiàn)在數(shù)字PCR需要進行分區(qū)后擴增，而熒光定量PCR是不需要分區(qū)擴增，而這種分區(qū)即可實現(xiàn)核酸分子的單分子擴增，單分子擴增既可以提高擴增效率，同時可以提高熒光檢測的靈敏性和數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。
圖2.數(shù)字PCR操作流程
數(shù)字PCR分區(qū)方法
數(shù)字PCR的主要核心點在于將PCR反應(yīng)液分區(qū)至數(shù)萬微反應(yīng)單元，實現(xiàn)單分子擴增。不同廠家利用不同方法實現(xiàn)核酸分子的分區(qū)，目前數(shù)字PCR分區(qū)方法主要包括3種：微流體數(shù)字PCR(Microfluidicdigital PCR，mdPCR)、微滴數(shù)字PCR(Dropletdigital PCR，ddPCR)和芯片數(shù)字PCR(Chipdigital PCR，cdPCR)。分別通過微流體通道、微液滴或微流體芯片實現(xiàn)分液，分隔開的每個微小區(qū)域都可進行單獨的PCR反應(yīng)，其中mdPCR基于微流控技術(shù)，對DNA模板進行分液，微流控技術(shù)能實現(xiàn)樣品納升級或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應(yīng)體系結(jié)合，mdPCR已逐漸被其他方式取代；ddPCR技術(shù)，是相對成熟的數(shù)字PCR平臺，利用油包水微滴生成技術(shù)，目前的儀器主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系統(tǒng)和RainDance公司的RainDropTMdPCR系統(tǒng)，其中Bio-rad公司的dPCR系統(tǒng)利用油包水生成技術(shù)將含有核酸分子的反應(yīng)體系生成20000個納升級微滴，經(jīng)PCR擴增后，微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測；cdPCR利用微流控芯片技術(shù)將樣品的制備、反應(yīng)、分離和檢測等集成到一塊芯片上，目前的儀器主要有Fluidigm公司的Bio-Mark™基因分析系統(tǒng)，Life Technologies公司的QuantStudio系統(tǒng)和JN Medsys公司的Clarity系統(tǒng)。利用集成流體通路技術(shù)在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，通過不同的控制閥門控制溶液在其中的流動來實現(xiàn)生物樣品的分液、混合、PCR擴增，實現(xiàn)絕對定量。
在這里我們以杭州紐藍科技有限公司和JN medsys公司的芯片式數(shù)字PCR為例，帶大家觀看數(shù)字PCR如何實現(xiàn)核酸絕對定量。
dPCR與qPCR比較
實時熒光定量PCR可以進行絕對定量和相對定量，其中絕對定量是用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量，標準品可選擇純化的質(zhì)粒DNA或體外合成的ssDNA等，其實qPCR的絕對定量是相對標準品的定量，并非完全地絕對定量；相對定量通過內(nèi)參等進行換算起始樣品中DNA的相對含量。數(shù)字PCR是基于傳統(tǒng)PCR、實時熒光定量PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第3代PCR技術(shù)，它不需要標準品，也不要制作標準曲線，即能實現(xiàn)更靈敏、更準確的絕對定量。同時，數(shù)字PCR是單分子擴增技術(shù)，能夠有效避免反應(yīng)抑制劑的影響。隨著反應(yīng)室的增加，反應(yīng)受到抑制劑的影響就越小。
dPCR應(yīng)用
數(shù)字PCR明顯的優(yōu)勢，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于核酸檢測的方方面面。腫瘤液態(tài)活檢，遺傳生殖檢測，公共衛(wèi)生檢測，環(huán)境微生物檢測，RNA表達檢測，NGS文庫定量，甲基化檢測的等。后期將推出數(shù)字PCR具體的應(yīng)用，歡迎大家持續(xù)關(guān)注。也希望大家了解數(shù)字PCR后，能夠更好地解決目前難以解決的問題。
