1.那些年我們愛過的PCR之PCR技術(shù)發(fā)展歷程
遙想當年，我們還是懵懂少年，在學(xué)校里無憂無慮的做實驗。那會兒剛開始接觸到聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR），覺得這是一個神奇的實驗平臺，可以把含量極少的DNA片段擴增變成海量片段，從而輕而易舉的檢測出我們想要的目的基因片段。這個時候我們的狀態(tài)大概是這樣的：
然鵝，理想很豐滿，現(xiàn)實很骨感，做了一段時間PCR實驗后我們發(fā)現(xiàn)會出現(xiàn)很多不太令人滿意的結(jié)果，比如這樣：
大家可能會問，到底是哪里出了問題？為什么會沒有預(yù)期的條帶？說實話，這個問題真是不太好回答，因為導(dǎo)致PCR未擴增或者非特異擴增的因素很多，比如模板含有雜質(zhì)、退火溫度不合適、反應(yīng)體系不夠優(yōu)化等等。由于PCR或者準確的說終點PCR只能在反應(yīng)結(jié)束之后，通過凝膠電泳等方法對產(chǎn)物進行檢測，不能反映整個PCR擴增的實時狀態(tài)，因此很難判斷問題到底出在哪。
這個時候，偉大的科學(xué)家們發(fā)明了熒光定量PCR（qPCR）檢測技術(shù)，通過染料或者探針釋放熒光，實時監(jiān)控每一個PCR循環(huán)的熒光變化，最后生成擴增曲線，如果是染料法，最后還可以生成熔解曲線，分析產(chǎn)物的特異性。怎么樣，是不是突然感覺柳暗花明又一村了。
然鵝，我們還是太年輕太天真，做了一段時間qPCR實驗后我們發(fā)現(xiàn)檢測靈敏度不夠，沒法做絕對定量等等，似乎困難重重。
不要捉急，曙光就在眼前，下面讓我來為大家開啟一扇新世界的大門，隆重歡迎PCR界的小鮮肉，數(shù)字PCR閃亮登場。
2.數(shù)字PCR橫空出世之dPCR檢測原理
數(shù)字PCR即Digital PCR（dPCR)是這幾年才迅速發(fā)展起來的一種核酸定量分析技術(shù)，雖然出生的晚，但是潛力不小，因為數(shù)字PCR解決了qPCR這么多年懸而未決的問題，那就是不依賴于標準曲線的絕對定量并且可以將檢測靈敏度提高至單個核酸分子。那它是怎么做到的呢？這要從它的檢測原理說起。數(shù)字PCR通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元（微滴），包含一個或多個拷貝的核酸分子(也就是說我們所說的 DNA 模板) ，這是與PCR或qPCR反應(yīng)最大的區(qū)別，PCR或qPCR只在一個反應(yīng)體系中進行，而數(shù)字PCR在每個反應(yīng)單元（微滴）中都會對目標分子進行擴增，擴增結(jié)束后統(tǒng)計熒光信號并分析。是不是聽起來特別高(yi)大(lian)上(meng)？舉個栗子，PCR或qPCR檢測突變像是在大海里撈一個會發(fā)光的針，周圍都是海水，很難看到針的光在哪，而dPCR就像把海水盛到好多個碗里面，瞧一眼很容易就知道哪個碗在發(fā)光了，而且，系統(tǒng)還會數(shù)出來到底有多少個碗里是發(fā)光的，多少個碗里是沒發(fā)光的，這樣一比，不就很容易的知道有多少數(shù)量的突變，就能做到絕對定量了。
舉了半天栗子，手都酸了，可能很多人還是會說，道理我都懂，但是怎么做到的呢？
要知道，盡管dPCR的檢測和分析原理很早就被提出來了，但是無奈受限于當時的技術(shù)條件，樣本稀釋與分配大多數(shù)都是靠手動操作完成的，受到很多因素的干擾和限制。最重要的是，結(jié)果分析對于研究者來說簡直是噩夢，十分的枯燥和繁瑣，他們的內(nèi)心應(yīng)該是拒絕的。
所以在很長一段時間內(nèi)，dPCR的發(fā)展停滯不前，直到微流控技術(shù)與微納集成制造工藝給dPCR過程中幾個關(guān)鍵技術(shù)問題提供了解決方案。簡單說來就是這兩項技術(shù)的發(fā)展幫助dPCR研究與商業(yè)化平臺發(fā)展突破瓶頸。然后，正如我們看到的，全球多家生物醫(yī)療儀器公司在這個領(lǐng)域開展了激烈的競爭，也誕生了多個儀器設(shè)備，我們來看一下。
根據(jù)樣品稀釋分配方式不同，dPCR 技術(shù)可以分為三大類，一個是基于大規(guī)模集成微流控芯片（a），微反應(yīng)室/孔板（b）和微滴式（c）。
目前市場上常見的2款dPCR儀器QuantStudio 3D 和QX200分別是基于微反應(yīng)室（b）和微滴式（c）技術(shù)開發(fā)的，兩者在檢測參數(shù)上略微有些差異，請看下面的表格。
此外，兩者各自都有一些優(yōu)缺點，比如，QuantStudio 3D運行需要ThermoFisher配套的芯片，但試劑可以通用；QX200運行不需要芯片但是需要Bio-Rad配套試劑；QX200 需要多次移液操作，容易產(chǎn)生是微滴融合，QuantStudio 3D一次只能加載一張芯片，操作相對繁瑣等。3.dPCR不只是傳說之數(shù)字PCR的應(yīng)用其實大家也不用太在意這么多可能連外星人都看不懂的檢測原理和對比分析，俗話說得好，不看廣告看療效，是騾子是馬還得拉出來遛遛（偷笑）。數(shù)字PCR檢測其實離我們越來越近，下面我們以幾個臨床案例研究來舉例，展示數(shù)字PCR巨大的臨床應(yīng)用前景（敲黑板）。通過檢測T790M位點突變情況，可以更好地評估一代TKI藥物的療效及耐藥情況并指導(dǎo)第三代TKI靶向藥Osimertinib的使用。然而，由于qPCR平臺ARMS檢測技術(shù)的靈敏度有限，沒有辦法在含大量EGFR基因野生型背景核酸中高效準確的檢測到T790M突變。這個時候dPCR技術(shù)展現(xiàn)出了無與倫比的檢測精度，此外，dPCR絕對定量的優(yōu)勢也能充分發(fā)揮出來了，可以監(jiān)控突變含量變化，做到及早發(fā)現(xiàn)耐藥[1]。伊馬替尼（Imatinib）可以有效幫助很多慢性髓細胞白血?。–ML）患者延長生存期，但是臨床上發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼的療效與BCR-ABL1融合基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達量有很大的關(guān)系。研究人員采用dPCR對CML患者的BCR-ABL1融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行測定，結(jié)果檢測下限可以達到0.001%，顯示出dPCR在痕量核酸檢測方面比qPCR具有無可比擬的優(yōu)勢[2]。鐮狀細胞貧血（sickle cell anemia）是HBB基因突變引起的常染色體顯性遺傳病，有嚴重的危害，可以導(dǎo)致高達5%的胎兒死亡率及4.62%的孕婦死亡率。而精準有效的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷是預(yù)防鐮狀細胞貧血患兒出生的有效方法。研究人員采用dPCR技術(shù)檢測孕婦胎兒游離DNA（cff-DNA）HBB基因突變。結(jié)果顯示，dPCR技術(shù)能夠確定87%的男性胎兒（n=45）和75%的女性胎兒（n=20）HBB基因的突變狀態(tài)。當cff-DNA濃度大于7%時，可以100%的檢測出HBB基因突變[3]，可以說是相當厲害了。dPCR在其他很多領(lǐng)域，比如食品安全、環(huán)境微生物檢測等也有著廣泛的應(yīng)用，由于篇幅有限，這里就不在贅述了。最后再啰嗦一句，我們看到，隨著dPCR的誕生，古老的PCR技術(shù)又煥發(fā)出新的活力，我們期待dPCR能夠給精準醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來新的動力，解決更多臨床和科研面臨的難題，造福更多的人。
參考文獻
1. Oxnard G R, Paweletz C P, Kuang Y, et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clinical cancer research, 2014, 20(6): 1698-1705.
2. Jennings LJ, George D, Czech J, et al.Detection and quantification of BCR-ABL1 fusion transcripts by droplet digital PCR.J Mol Diagn. 2014 Mar;16(2):174-9.
3. Barrett AN, McDonnell TC, Chan KC, Chitty LS. Digital PCR analysis of maternal plasma for noninvasive detection of sickle cell anemia. Clin Chem. 2012 Jun;58(6):1026-32.
注：文中漫畫引用于Sketching Science @Facebook，部分數(shù)據(jù)引用于《數(shù)字PCR--原理、技術(shù)及應(yīng)用》一書。
